基质效应(matrix effect/ matrix interference)是指样品中的其他物质可能对检测目标分析物的能力产生影响，在对生物样品如血清、血浆、组织匀浆等的免疫检测中最为常见，因为这类样品中的许多成分如碳水化合物、蛋白质、磷脂、代谢物等会干扰抗体与其目标的结合，或抑制或增强信号，影响分析物的准确定量[1]。
在临床研究的生物分析中，基质干扰更是一个巨大的挑战，例如在血清和血浆中已经发现了多种类型的干扰，通常是内源性物质如类风湿因子、嗜异性抗体(针对不明确的抗原产生的抗体，呈现低亲和力和弱结合)、人抗动物抗体(HAAA,当免疫系统与动物抗体接触时产生的高亲和力抗体)以及其他血浆蛋白，如白蛋白、溶菌酶、纤维蛋白原等[2]，这些干扰因素直接影响检测的灵敏度、特异性和变异性，导致分析物定量不准确。
减少基质效应的最基本方法是样品稀释，但前提是稀释后分析物的水平仍在线性范围内，而且稀释会影响检测灵敏度，所以并非通用的策略。优化缓冲液pH和离子强度也有助于减少非特异性相互作用。其他克服干扰的策略包括加入与干扰分子结合或竞争的物质，如用适当的动物血清鸡尾酒来被动去除人类抗鼠抗体(HAMA)，使用嗜异性抗体抑制剂如嗜异性阻断试剂(HBR)和免疫球蛋白抑制试剂(IIR)、或使用缺乏Fc片段的F(ab′)2或单链片段(scFv)作为捕获/检测试剂等[3]，然而这些方法大多数都是劳动密集型的且价格昂贵，对于大样本量的研究并不实用。
对于基于配体结合试验(ligand binding assay, LBA)的免疫检测，减少孵育时间或检测试剂与基质接触的时间已被证明是克服基质效应的有效手段之一[4]。Gyrolab®在微流控的CD上实现亲和柱流穿模式，从而最大限度地减少了试剂与基质的接触时间，将基质干扰最小化。Bristol-Myers Squibb公司的Shannon D Chilewski等人[5]利用Gyrolab®平台解决了临床前PK研究中的基质干扰问题。
该案例是在对某一PEG化抗体的PK检测中观察到了来源于人抗动物抗体(HAAA)的基质干扰。在药物发现阶段，用于支持单次给药剂量递增(single ascending dose，SDA)研究的检测方法是基于电化学发光检测(ECL)的方法，以靶点分子为捕获试剂，山羊抗Vk抗体为检测试剂，样品稀释度为50倍，定量下限LLOQ为80ng/mL。
但当从发现阶段过渡到开发阶段时，要求更低的检测灵敏度并同时保持或提高准确性和精确度，而且因为以下三个原因，ECL检测方法80ng/mL的LLOQ已不适合支持下一阶段的研究：
1 开发团队对该药物在较低剂量下的半衰期特征感兴趣，如果沿用目前的检测方法，结果会
2 希望在受体占有率EC50为78ng/mL时测量循环中的药物浓度；
3 在出现免疫原性的情况下，抗药抗体可能对药物有清除作用，降低循环中的药物水平，所以推断该检测方法对较低剂量下的药物定量会进一步受限。
为了提高检测灵敏度，将LLOQ拓展至所要求的30ng/mL，研究团队探索了采用Gyrolab®平台和新试剂组合，在有限的时间内快速开发新的检测方法。
首先在Gyrolab®上对捕获和检测试剂组合进行了筛选，以山羊多克隆抗药抗体作为捕获试剂，小鼠抗特别型单抗作为检测试剂，这一组合显示出最佳性能，捕获抗体浓度为100µg/mL，检测抗体浓度为2500ng/mL。使用Gyrolab® Bioaffy 200 CD(样品体积200nL)和标准的Gyrolab®三步法(捕获-分析物-检测)进行分析, 样品稀释MRD为2。
PBS-T作为稀释缓冲液(PBS + 1% BSA + 0.05% Tween-20)，样品稀释2倍。在3天内进行了6次CD测试。每张CD包括一条标准曲线和6个级别QC样品的4个重复。标准曲线范围为30-2000ng/mL，锚点为2500ng/mL。QC样品在100%人血清中稀释125倍，然后用检测缓冲液稀释2倍，以使浓度落在测定范围内。表1显示所有结果都有良好的检测准确度和精确度。
分别用PBS-T缓冲液和Gyros专利的Rexxip H缓冲液(Gyros)稀释样品进行平行比较。 由于检测方法中含有小鼠单抗，人抗鼠抗体HAMA是潜在干扰源，而Rexxip H缓冲液含有中和嗜异性抗体的成分，所以使用Rexxip H稀释后应能抑制基质干扰信号。
20个血清样本(10个正常人的血清NHS1-10，10个患病人群的血清DPS1-10)以30ng/mL的LLOQ浓度掺入药物进行分析，所有20个样本也都进行了未加标的分析。验收标准：80%的加标样品需要在标称浓度±25%的偏差范围内回收，所有未加标样品的回收必须低于LLOQ。结果(表2)显示，正常人血清样本使用Rexxip H缓冲液稀释后符合目标接受标准。正常人血清2号样品，使用PBS-T的回收率为252.6%，使用Rexxip H的回收率在25%以内，说明Rexxip H缓冲液非常好的消除了该样本中的基质干扰。其中两个疾病血清样本在未加标样时，即使使用Rexxip H缓冲液，其反算浓度为32~35ng/mL。因此，在对疾病人群的研究设计中，必须重复加标实验，将LLOQ设计为40ng/mL。
总结：
将电化学发光(ECL)检测方法(LLOQ 80ng/mL)转移到了Gyrolab®平台上，使用优化后的抗体对和缓冲液，产生了灵敏度更高的检测结果，将LLOQ改进至30ng/mL, 可以满足未来研究的要求。
Gyrolab® 平台的亲和柱流穿模式以及专利的Rexxip 缓冲液可以最大程度的降低基质效应造成的数据准确度和灵敏度的下降。
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参考文献：
[1]. Selby C. Interference in immunoassay. Ann. Clin. Biochem. 36(Pt 6), 704–721 (1999).
[2]. Ana I. Barbosa, Nuno M. Reis. Antibody Surface Coverage Drives Matrix Interference in Microfluidic Capillary Immunoassays. ACS Sensors 2021 6 (7), 2682-2690.
[3]. Williams K, Erickson R, Fischer SK. Overcoming disease-specific matrix effect in a clinical pharmacokinetic assay using a microfluidic immunoassay technology. Bioanalysis, 9(16), 1207–1216 (2017).
[4]. Saloumeh K. Fischer. Ligand binding assay technologies: matching the right tool to your bioanalytical challenge. https://www.bioanalysis-zone.com.
[5]. Shannon D Chilewski. Addressing matrix effects in ligand-binding assays through the use of new reagents and technology.Bioanalysis (2014) 6(8), 1059–1067.
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更新时间：2025-06-25
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