在Gyrolab® 免疫分析平台上评估Progen AAV 滴度测定ELISA

　　基于重组AAV的载体是目前基因疗法中使用最为广泛的、被大家认可为安全有效的载体。AAV是一种单链DNA病毒，免疫原性非常低，其基因组以附加体 (episome) 形式存在于宿主细胞核中，可长期稳定地表达外源基因。目前已经发现了11种具有不同组织嗜性的AAV血清型，使AAV成为基因治疗的特定组织靶向的有用工具。

　　在基因疗法生产和非临床或临床研究中，用于AAV载体表征的分析方法面临着诸多挑战。优化病毒生长的条件是缓慢而费力的，而且没有实时的 "在线 "检测方法可用。对病毒滴度进行定量既耗时又费钱，如果用CD50检测法测定感染性滴度，可能需要6周才能得到感染性结果，而此时生物反应器的运行已经完成。除此之外，治疗药物的上市时间至关重要，因为许多基因疗法是针对罕见病或个性化医疗的，而且往往是从第一阶段开始就进入快速审批通道，这意味着没有多少时间来进行检测方法开发和验证，所以快速地检测开发和样品分析是一个关键需求。此外，载体生产是一个昂贵的过程，产生的最终产品非常少，例如一个200L的生物反应器的产品最终可能浓缩到不到20mL，这意味着能够处理非常小的样品量的分析方法是非常重要的。

　　在载体的工艺开发和放行检测中，ELISA免疫测定法通常用于载体物理滴度 (载体总颗粒) 和工艺杂质检测，本案例研究的目的是展示将Progen AAV滴度测定ELISA转移到Gyrolab® 免疫测定系统中，以快速分析时间和减少样品量来表征AAV的生产制备。与手动ELISA相比，Gyrolab检测法是稳健的，检测性能良好，具有更好的灵敏度和动态范围，再加上Gyrolab快速分析非常小的样品量的能力，使开放的Gyrolab平台成为一个有价值的工具，可快速提供时间敏感的结果，支持基因治疗开发和生产过程中的决策。

　　一、将Progen AAV ELISA转移到Gyrolab

　　Progen夹心法ELISA (Progen Biotechnik GmbH, Heidelberg, Germany) 支持定量测定细胞培养上清液和血清型1、2、3、5、6、8和9的纯化病毒制剂中的AAV颗粒。该ELISA可用于滴定完整的AAV野生型病毒、AAV重组病毒或组装的和完整的AAV空衣壳。

　　Progen ELISA包括一个包被的单克隆抗体 (A20R)，该抗体对组装的AAV衣壳上的构象表位有特异性，以捕获样品中的AAV颗粒 (图1)。用生物素化AAV2单克隆抗体检测病毒颗粒，然后用链霉菌素-辣根过氧化物酶结合物与生物素分子结合，通过使用底物的颜色反应进行检测。Gyrolab免疫测定是基于同样的试剂，采用Progen公司经过严格验证的金标准抗体A20R，但使用了用Alexa Fluor® 647标记的抗体进行荧光检测 (图1)。

　　图1.  测定AAV滴度的ELISA和Gyrolab检测形式

　　二、检测方法的优化

　　1.Gyrolab Bioaffy™ CD优化

　　使用Gyrolab Bioaffy 200和Gyrolab Bioaffy 1000 CD对AAV2的Gyrolab免疫测定进行了比较 (图2)，数据表明Gyrolab Bioaffy 1000 CD表现最好，与目前的ELISA方法相比，该Gyrolab测定的灵敏度和动态范围有所提高。

　　图2. Gyrolab Bioaffy 200 (橙色) 和Gyrolab Bioaffy 1000 (蓝色) CD的性能比较。捕获试剂：Progen抗体，100 μg/mL，在PBS-T配制；检测试剂：用Alexa Fluor 647标记的Progen抗体，5 μg/mL，在Rexxip F缓冲液中配制。
 

　　2.捕获和检测试剂以及缓冲液

　　Progen和Gyros Protein Technologies公司的捕获和检测试剂的性能相当 (数据未显示)，本研究使用了Progen的抗体试剂。在Bioaffy 1000 CD上测试的三种Rexxip缓冲液 (A、F和HX) 和Progen ASSB的比较表明，Rexxip缓冲液在重复中的CV较小，因此本评估选择了标准的Rexxip A稀释液 (数据未显示)。

　　测试了三种浓度的检测试剂 (2.5、5和10 μg/mL)，并给出了平行曲线 (图3)。5 μg/mL的检测试剂浓度提供了更好的信噪比，因此在这次评估中选择该浓度。

　　图3. 检测试剂浓度的优化。CD：Bioaffy 1000；捕获试剂：Progen抗体，100 μg/mL，在PBS-T中配制；检测试剂 ：2.5、5或10 μg/mL，在Rexxip F缓冲液中配制。
 

　　三、检测性能

　　1.分析范围

　　图4. Gyrolab AAV2免疫测定法与ELISA的分析范围
 

　　Gyrolab免疫测定的分析范围是用1:2连续稀释制备的标准曲线来确认的。该范围估计为5.4 x 10^6 - 5.5 x 10^9 capsids/mL (3 logs)，比ELISA的范围约4 x 10^7 - 2.5 x 10^9 capsids/mL (近2 logs，数据来自Progen QC证书) 更宽 (图4)。这种更宽的动态范围允许使用纯样品进行分析，而这在ELISA中是不可能的。此外，与Progen ELISA消耗100 μL样品量相比，Gyrolab免疫测定法仅需10μL，样品量要求减少了10倍。

　　2.准确性与精密度 

　　在Rexxip A缓冲液中添加标准品，3个QC样品为2000、100和 10 x 10^6 capsids/mL，结果显示出良好的准确性和精度 (表1)。

 

　　3.稀释线性度

　　表2. Gyrolab AAV2免疫测定法的稀释线性度

　　在分析范围内进行三次稀释，平均浓度为2.5 x 10^10 capsids/mL，稀释线性良好。

　　四、总结

　　AAV2定量检测成功地转移到Gyrolab平台上，与Progen AAV滴度ELISA相比，Gyrolab检测动态范围更广，方法开发和检测优化非常迅速，只需要在1天半的时间内进行6次运行，而使用手动Progen ELISA进行同样数量的运行需要3-6个工作日。与ELISA相比，Gyrolab检测的灵敏度和动态范围有所提高。

　　Gyrolab检测的优势：

　　1.灵敏度高 ，能够检测到ELISA无法检测到的低浓度样品

　　2.更宽的分析范围 (5.4 x 10^6 - 5.5 x 10^9 capsids/mL，3 logs)，而ELISA为1.5 logs

　　3.高通量 (96个数据点/60分钟，500个数据点/每天)

　　Gyrolab的检测优势，再加上Gyrolab在高效的工作流程中快速分析非常小的样品量的能力，使Gyrolab平台成为基因治疗开发和生产的宝贵工具，赋能用户更快做出数据驱动的决策。